基因组组装评估 --- QUAST

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Background

现今，大多数现有的比较组装的方法仅适用于已完成基因组的新组装，尚未充分考虑评估以前未测序的物种组合的问题。当前的测序技术和软件面临着许多阻碍完整染色体重建的复杂性，包括读取错误和基因组中的大量重复。不同的组装程序使用不同的启发式算法来应对这些挑战，从而导致它们输出的 contigs 存在许多差异。这也导致了如何评估组装质量以及如何比较不同组装的问题。

contigs：基因组组装软件将 reads 组装成更大的区域，便称为重叠群（contigs）。

Plantagora：是一个基于网络的平台，旨在帮助科学家查看最流行的植物基因组测序策略的特征（包括测序平台和组装软件）。[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3236183/]

Assemblathon competition：该竞赛在超过100个评估指标上比较了41个 de novo assemblies；其评估脚本是免费提供的，但它们高度关注比赛中使用的基因组，普通用户很难将其应用于其他基因组。[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3227110/]

GAGE: 被用来在四个数据集上评估几个领先的基因组组装工具，其评估一组指标，包括不同类型的错误组装（倒置，易位）[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3290791/]

需要注意的是，Plantagora 和 GAGE 是基于已知参考基因组的数据对组装进行评估的，它们并不适用于以前未测序的基因组的组装。此外，GAGE 一次只能在一个数据集上运行，因此，要比较同一数据集上的多个组装，必须手动将不同 GAGE 报告的输出合并到一个表格中。

Introduction

QUAST 一种用于评估和比较基因组组装的质量评估工具；其可以使用参考基因组和不参考基因组的情况下对组装进行评估。QUAST 将会生成许多报告、汇总表和图表。此外，QUAST 在最耗时的步骤做了并行化，运行速度相当快。

QUAST 使用来自 MUMmer v3.23 的 Nucmer 比对工具将组装与参考基因组比对，并根据比对评估指标。

Metrics（指标）

Contig sizes

可以在有或没有 reference 的情况下评估以下指标（除 NGx )。此外，Quast 可以对输入进行过滤，仅限于长度超过指定最小长度的 contigs，以排除可能没有多大用处的短重叠群。

  • No. of contigs: 组装中的 contigs 总个数。
  • Largest contig: 最长 contig 的长度。
  • Total length: assembly 中的碱基总数。
  • Nx (where 0<=x<=100): 最长长度的 contigs 占组装碱基的百分比。
  • NGx, Genome Nx: 相等或更长的重叠群产生参考基因组长度的 x% 的重叠群长度，而不是组装结果长度的 x%。

Misassemblies and structural variations（组装错误和结构变化）

该指标描述重叠群中的结构错误。Quast 只能根据已知的参考基因组对它们进行评估，如参考基因组与组装的数据集完全匹配，则差异可能归结于软件的错误组装或测序错误（如嵌合读取）。

  • No. of misassemblies: 组装错误的数量。
  • No. of misassembled contigs: 包含错误组装断点的 contigs 数量。
  • Misassembled contigs length: 在所有 contig 中包含一个或多个错配的碱基总数。
  • No. of unaligned contigs: 与参考序列没有对齐的 contigs 数量。
  • No. of ambiguously mapped contigs: 在参考基因组的多个位置具有相同质量的高得分参考比对的 contigs 数量。
  • 除了以上汇总统计数据之外，Quast 还生成包含每个 contig 详细信息的报告，包括 ccontig 是否未对齐、不明群映射、错误组装或正确。

Genome representation and its functional elements（基因组表示及其功能元件）

评估重叠群中基因组表示的指标以及组装的功能元件的数量，如基因和操纵子。其中大多数需要参考基因组。

  • Genome fraction (%): 参考中比对碱基的总数除以基因组大小。如果至少一个重叠群与该碱基具有至少一个比对，则参考基因组中的碱基被记为比对。来自重复区域的重叠群可能会映射到多个位置，因此可能会以这个数量计算多次。
  • Duplication ratio: 组装中对齐的碱基总数（即总长度减去未对齐的重叠群长度）除以参考中对齐的碱基总数。若组装包含许多覆盖参考相同区域的重叠群，则其重复率可能远大于 1。这可能是由于高估了重复多重性以及由于重叠群之间的 small overlaps 等原因而导致的。
  • GC (%): 组装中的 GC 含量，组装中的 G+C 碱基含量除以总碱基数。
  • No. of mismatches per 100 kb: 每 100,000 个对齐碱基的平均错配数。该指标不区分单核苷酸多态性（组装基因组与参考基因组的真正差异）和单核苷酸错误（由于读取错误或组装算法错误）。
  • No. of indels per 100 kb: 每 100,000 个比对碱基的平均单核苷酸插入或缺失数量，此外还提供包含所有组件的插入缺失坐标的详细报告。
  • No. of genes: 组装结果中的基因数量（完整和部分），基于用户提供的参考基因组中基因位置的注释列表。
  • No. of operons: 使用用户提供的参考基因组中操纵子位置的注释列表，以与基因类似的方式计算完整和部分操纵子。
  • No. of predicted genes: Quast 的基因查找模块预测的组装中的基因数量，该模块基于原核生物的 GeneMark.hmm 和真核生物的 GlimmerHMM。

Variations of N50 based on aligned blocks（基于对齐块的 N50 变化）

新指标 NAx 和 NGAx。

需要注意的是：这两个指标都需要参考基因组。如果参考基因组和正在组装的样本不同，一些断点和插入缺失可能代表真正的结构差异。

  • NAx (A stands for aligned; x ranges from 0–100): Nx 和 Plantagora 的错误组装数的组合。分两步计算；首先，我们将 contigs 分成对齐的 blocks。如果一个 contig 有错误组装断点，它会在这些断点处分成多个 block。此外，如果重叠群中有未对齐的区域，这些区域将被移除，并将重叠群分割成块。接着，我们计算这些 blocks 上的普通 Nx 统计量，而不是原始的 contigs。
  • NGAx: 按照 NAx 的描述将 contigs 分成对齐的 blocks ，然后计算这些 blocks 的 NGx 统计量（而不是 Nx）。

Visualization（可视化）

QUAST 以图形形式呈现大量的统计数据，并支持 SVG、PNG、PDF 格式。

  • Nx-like plots: 显示随着 x 变化的 Nx、NGx、NAx、NGAx 指标的趋势，这比仅使用 N50 提供更多信息。
  • Cumulative plots: 对于所考虑的所有类型的累积图，重叠群按碱基数从最大到最小排列。累积长度图显示前 x 个 contigs 中的碱基数，因为 x 从零变化到 contigs 的数量。类似地计算完整基因的累积数量和完整操纵子的累积数量。
  • GC content plots: 显示重叠群中 GC 含量的分布。x 值显示 Gc 的百分比。y 值显示 GC 内容为 x 的非重叠 100bp 窗口的数量。这种分布通常是 高斯分布；但是如果存在具有不同 GC 含量的污染物，通常会出现多个 高斯叠加。
  • Contig alignment plots：显示重叠群与参考基因组的比对以及这些重叠群中错配的位置；颜色编码指示块边界何时由多个组件共享，并显示错误组装的块。可选轨道显示参考基因组的读取覆盖度。正确对齐的重叠群将显示为 蓝色，否则为 绿色。如果边界在至少一半的组件中一致，则具有错误组装的重叠群被分成块并涂成 橙色，否则是 红色。重叠群垂直交错并以不同的颜色深浅显示以区分单独的重叠群，包括小的重叠群。
  • 此外，QUAST 还制作了几个指标的比较直方图：完整基因的数量、完整的操纵子数量、基因组分数（%）。

Installation

关于生物的一系列工具安装，我们首先想到的应该是有无 conda 可以从对应的库下载安装。这将会减少许多其他不确定因素。

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## 通过 conda 直接安装 QUAST 在我的服务器上有点困难，于是我通过 conda 先创建一个 python 环境，再通过 pip 安装 QUAST。
conda create -n Quast -c bioconda quast
## 创建一个环境：Quast ； 并安装 quast
## 目前最新的 Version ： v5.0.2
## 其他安装方法：http://quast.sourceforge.net/install.html

conda create -n Quast python=3.6.7 -y
pip install quast matplotlib
## matplotlib 是支持生成 PDF 图像文件的必须模块。
conda activate Quast
conda install -c bioconda bwa bedtools minimap2 -y  ## QUAST 的一些子模块需要用到这几个比对程序。

Run

在命令行中运行，首先需要启用上面我们创建的环境 Quast

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conda activate Quast
quast.py [options] <contig_file(s)>

Options

参数 描述
-o 输出文件夹，默认为 quast_results/results_
-r 参考基因组 fasta 文件，可压缩。若省略，则只产生在没有参考的情况下的评估
-g 包含参考基因组中基因组特征位置的文件，即 GFF。
-m contigs 长度的最低阈值（bp 为单位）。默认为 500bp。不会考虑小于 -m 长度的 contigs
-t 设置最大线程数，默认为所有可用 CPU 的 25%。
-s 当组装不是 contigs ，而是 scaffolds 时，通过该参数进行拆分；--split-scaffolds。
-l 标签，这里设置的 names 将被用于 reports、plots、logs。设置人类可读的组装名称（assembly names）
-L 从它们的父级目录中获取组装名称
-e --eukaryote；代表组装为真核生物，这将影响基因发现、保守同源物发现和重叠群比对；该选项表明基因组不是环状的。
--fungus 表明基因组为真菌。该选项表明基因组不是环状的。
--large 基因组很大（> 100Mbp），使用最佳参数评估大型基因组，这将影响分析速度和准确性。
-k --k-mer-stats；计算基于 k-mer 的质量指标；推荐用于大型基因组，默认禁用。
--k-mer-size --k-mer-stats 选项中使用的 k 的大小。默认值为 101bp。对于杂合度高的基因组使用较小的值。但是，需要注意的是，对于存在大量重复的基因组，非常小的 k-mer 可能会给出不相关的结果。
--circos 绘制 lcarus contig 对齐查看器的 Circos 图。QUAST 未嵌入 Citcos 程序，如未安装 Circos ，则只会创建 Circos 配置文件。
-f --gene-finding；启用基因查找功能。即预测组装基因组中的基因元件。
--min-identity 最小 IDY% 被视为正确对齐。 IDY% 比该值差的对齐将被过滤。默认值为 95.0 %。请注意，无论此阈值如何，IDY% 小于 80.0% 的所有对齐都将被过滤。
-i --min-alignment；对齐的最小长度（bp），低于该值的比对将被过滤，请注意，无论此阈值如何，所有短于 65 bp 的对齐都将被过滤。
--plots-format 绘图的文件格式；支持的格式：emf、eps、pdf、png、ps、raw、rgba、svg、svgz。默认格式为 PDF。
--no-sv 不要运行结构变异处理（仅在指定 reads 时才有意义）
--upper-bound-assembly 根据参考基因组和给定的 read sets 模拟上限组装（需要 Pacbio SMRT/Oxford Nanopore）。可用于估计理论上可以通过组装工具从该特定 read sets 达到的完整性和连续性的上限。该概念基于以下事实：由于基因组重复长和覆盖区域少，参考基因组无法从原始 reads 中完全重建。[http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/bty266]；若只想得到上限，可设置 --no-sv 和 --no-read-stats 来取消对应附加分析。

以上参数只是一部分，更多参数设置请移步：http://quast.sourceforge.net/docs/manual.html

如果使用相同的输出目录重复运行，QUAST 会重用现有的对齐方式。因此，您可以在使用不同参数运行 QUAST 或将更多程序集添加到现有比较时有效地重用已计算的结果。

Result

敬请期待！！！

References

[1] Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N., & Tesler, G. (2013). QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics (Oxford, England), 29(8), 1072–1075. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086

[2] QUAST Installation

[3] QUAST 5.0.2 manual

[4] Github