高通量测序知识学习
Introduction
高通量测序(
high-throughput sequencing,HTS)，即下一代测序(next generation sequencing,NGS)，又称为大规模平行测序(massively parallel sequencing,MPS)
1. 高通量测序技术的特点
操作步骤多，程序复杂
1.1
湿桌实验过程(wet bench process)
实验室内的标本预处理，核酸提取及其片段化，建库，扩增，靶序列富集，混样(pooling)，测序前准备及测序。
1.2
干桌实验过程(dry bench process)
测序后的数据质量分析，比对，变异识别，注释和结果报告与解释等生物信息学分析流程(bioinfomatics pipeline)
2. 第一代测序技术
发展历史
| 时期 | 测序技术 | 说明 |
|---|---|---|
| 20世纪50年代 | Whitfld 等化学降解法测定无支链的RNA序列 | 操作复杂，并未广泛使用 |
| 20世纪60年代中期 | Robert 等利用小片段重叠法测定酵母丙氨酰-tRNA序列76个核苷酸序列 | 耗时7年之久 |
| 20世纪70年代初 | 华裔分子生物学家吴瑞提出位置特异性引物延申策略，并于1971年首次成功测定了λ噬菌体12个碱基的黏性末端序列 |
这是文献记载的最早的DNA序列分析方法；但仅限于测定DNA短序列 |
| 1973年 | Gibert和Maxam利用化学降解法测定Lac抑制子结构区24个碱基的DNA序列 | - |
| 1975年 | Sanger报道了更为简易的加减测序法(plus-minus sequencing) |
- |
| 1977年 | Sanger在加减测序法的基础上创建了双脱氧链终止测序法(dideoxy chain-termination method/Sanger sequencing) |
标志着第一代测序技术的诞生 |
| 1977年 | Gilbert和Maxam在原有方法的基础上合创了化学降解测序法 | 与双脱氧链终止测序法类似，标志着第一代测序技术的诞生 |
双脱氧链终止测序方法 与 化学降解测序法
原理大相径庭，但都是生成了相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸混合物，这些混合物有共同的起点，随机终止于一种或多种特定的碱基。通过对各组寡核苷酸混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，
PAGE)即可从放射自显影片上直接读出DNA核苷酸序列。
基于前人的探索，这一时期还出现了鸟枪法(shotgun method)，杂交测程序(sequencing by hybridization,
SBH)
- 优势：长读长、准确度高
- 不足：测序成本高、耗时长、通量低；以至于不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求
3. 第二代测序技术
随着历时13年耗资近3亿美元的人类基因组计划的完成，生命科学划时代地进入后基因组时代，即功能基因组时代。
第二代测序技术又称为大规模平行测序(
massively parallel sequencing,MPS)
| 时期 | 测序技术 | 说明 |
|---|---|---|
| 1996年 | Ronaghi和Uhlen建立了焦糖酸测序(pyrosequencing) |
与第一代测序技术最大的不同是边合成边测序 |
| 2005年 | 454 Life Sciences 公司划时代地推出了基于焦磷酸测序原理的 Genome Sequencer 20 测序系统 | 这是测序史上具有里程碑意义的大事件，改变了测序的规模化进程，成为第二代高通量测序的先行者 |
2009年以后出现了以单分子实时测序和纳米孔技术为代表的第三代测序，所以将2005年出现的高通量测序技术成为第二代测序技术
第二代测序技术的核心思想是：边合成边测序(sequencing by syntthsis,
SBS)，即通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA的序列；
- 优势：高通量、自动化、耗时短
5种主流二代测序平台：454(Roche), Solexa(Illumina), SOLiD(Life Technologies), Ion Torrent(Life Technologies), CG(MGI)
4. 第三代测序技术
第三代测序技术较前面的技术最大的区别是读长长，准确率低，难以用于临床、
理想的测序方法：对原始的DNA模板进行直接、准确测序且不受读长的限制。
第三代测序技术主要是指
单分子实时（single molecule real-time, SMRT）测序技术 和
纳米孔（nanopore）测序技术，实现了
长读长，单分子测序(不进行扩增)；
【第三代测序技术最大的缺陷：高错误率；故目前难以应用于临床实际】
准确率：
- PacBio
SMRT：单次测序仅有
85%准确度；可通过重复测序进行一定程度的纠正，但仍难以媲美二代测序的99.5% - ONT Nanopore：检测错误主要体现在对
Indel的检测
ONT Nanopore
测序技术的主要特点是：超长读长、读取速度快、高通量、便携性；样本制备过程简单，基因组无需进行亚硝酸盐处理便可直接读取甲基化的C，对在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。
参考书
[1] 《高通量测序技术》，李金明主编，科学出版社出版